立志虽已明确，但李时珍没有仓促动笔，他仍在收集整理、积累酝酿。
李时珍在行医的过程中，日子一长，他不仅名振蕲州，在荆楚一带也颇有名气。传到武昌的楚王朱英 佥耳里，适逢他的儿子患了重病，就把李时珍召去，为他儿子治病。李时珍略施医技，手到病除。楚王甚为高兴，就将他留下，任命为楚王府奉祠所的奉祠正，并以这个名义兼管良医所。
李时珍心之所系，全在《本草纲目》一书，为此他不放过任何一个学习与积累的良好机会。在楚王府里，他发现了许多在蕲州镇难以见到的珍贵书籍，不觉如饥似渴地读了起来。一段时间，他饱览了陶弘景的《名医别录》、孙思邈的《千金方》、掌禹锡的《图经本草》等医学典籍还读了不少经史百家、方志类书、稗官野史，为以后的创作积累了各种丰富的材料。
这样地过了几年，到了1558年四十一岁的时候，因其医术高明，李时珍又被楚王给推荐到北京皇宫任太医院判。
在太医院，李时珍常有机会出入寿药房和御药库。这里，堆放着各地进贡和国外进口的形形色色的药材。他欣喜若狂，对它们不断地比较、鉴别、研究。
当时的明皇朱厚熜，一味信奉方士仙丹，征求“不死药”，追求“长生不老”，李时珍对此极为反感。一年后，就借故托病辞职回乡了。
身不由己地奉召服务于楚王府与太医院的这段时间，《本草纲目》的写作计划显然受到了一定的影响。但是，他也由此而获得了更多的理论与实践知识，准备工作更为充分。
回到蕲州，他在雨湖边筑了一间新居，以唐慎微的《证类本草》为蓝本，根据自己的分类标准，开始了《本草纲目》的正式编撰工作。
有时，各家医书说法互相矛盾，舛误之处多多，弄不懂的地方也有不少。李时珍深感知识不够，经验不足，不得不时时停下手中的毛笔，穿上草鞋，背起药筐，拿着药锄，带上必要的药书与纸张，在徒弟庞宪和儿子李建元的陪伴下，足迹再次遍及蕲州一带的山山水水。
随着研究与创作的不断深入，许多药物在蕲州一带难以找到。为使《本草纲目》尽量充实、正确，不留遗憾，李时珍不得不远离故乡，多次外出旅行、考察、采药。时间长达数年，范围遍及大江南北。特别是在武当山一段的长时间旅行，收获更是不小，并在那里留下了不少生动感人的故事。
在我们这个有着悠久历史的古老国度里，曾经诞生过大批成千上万学究与腐儒，他们以书斋为限、以考据为癖、以寻章摘句为乐，以雕虫小技标榜，以书本印证书本为业……而李时珍与他们最大的区别与突出之处，就在于他的注重实践，将书本知识与社会实践融为一体！设想一下，如果这种治学风格形成传统，汇成一股蔚为壮观的潮水，千百年来不断冲刷着我们脚下这块板结的土地，那该出现一种多么令人振奋的可喜局面啊！
可惜的是，像李时珍这样的学者不过是中国几千年历史的漫漫长空里闪烁着的几颗为数极少的星辰，它们的光亮实在是太微弱了。
一边严谨著述，一边外出奔波、考察验证两者贯穿着李时珍创作《本草纲目》之始终。他披阅了八百多家著作，深入北京、河南、湖广、江西、江苏、安徽等地考察，访问了成千上万群众。直到五十多岁了，他还是那么精神饱满地行走在祖国的名山大川间，向农民、猎人、樵夫、渔民求教，向大自然寻找正确答案。即使回到家中，他也要亲自栽培、炮炙药物，对比野生、家莳的异同；掌握播种时间、收获季节对药效的影响；弄清土壤、施肥、灌溉等因素对药物生长的作用；研究炮炙的不同方法、工序繁简、时间长短、配料不同对药用的改变；他还对矿物药亲自炼制，曾将铅炼成胡粉、黄丹、密陀僧、铅霜等多种化合物……李时珍将这些反复验证的实践经验一一写入《本草纲目》，在很大程度上保证了该书的系统、丰富、完整与正确、有效、实用。
初稿完成后，李时珍又作了三次较大的修改，直到1578年，《本草纲目》才最后定稿。此时，李时珍已是一位六十一岁、白发苍苍的老人了。若从三十五岁那年挥毫写下“本草纲目”四个大字算起，这部医书，整整耗去了他二十七年时间。后半辈子光阴，二十七年心血，就这样变成了一个个浸透纸背的密密麻麻的墨迹。
李时珍一生勤奋，著述很多，见于文史记载的，还有《濒湖脉学》、《奇经八脉考》、《濒湖医案》、《集简方》、《五脏图论》、《三焦客难命门考》、《白花蛇传》等，但大多现已失传。目前完整保留下来的只有《本草纲目》、《濒湖脉学》、《奇经八脉考》三书。
《本草纲目》自1596年问世以来，已有四百多年历史。它在中国世代相传，共有六十多种版本。并以英、德、法、日、俄等多种文字的全译本、节译本，在世界各地广为流传，对东西方医学界、生物学界、矿物学界、文化界产生了广泛而深远的影响。
《本草纲目》一经问世，即将中国本草学研究推向了一个新的发展水平，医学界研究本草学蔚为成风，使得本草学臻于一门成熟的独立科学。
1956年，郭沫若为李时珍墓碑题词时恰如其分地评价道：“医中之圣，集中国药学之大成；本草纲目乃一千八百九十二种药物说明，广罗博采，曾费三十年之殚精。造福生民，使多少人延年活命。伟哉夫子，将随民族生命永生。”
《本草纲目》最早传到日本、朝鲜、越南、印度等地，被视为药物学宝典；后来通过传教士和驻华使馆人员传入西方，受到西方科学家的普遍重视。生物进化论创始人达尔文称赞《本草纲目》为“1596年出版的中国百科全书”，并在他的《动物和植物在家养的变异》一书中引用了有关《本草纲目》的资料。
鉴于《本草纲目》长期享誉世界并为东西方学者所共同推崇，世界和平理事会在1951年的维也纳会议上，一致决议将李时珍列为世界文化名人之一，受到世界各国人民的永远纪念。
那么，《本草纲目》何以具有如此长久的魅力？它究竟包含了哪些方面的科学内容？
《本草纲目》分为五十二卷，约一百九十多万字。全书正文收录了一千八百九十二种药物，每种药物都有详尽的释名、集解、气味、主治等解说，大多药物后面还附有历代经验药方，共计一万一千零九十六个。此外，该书还选介了四十一部历代诸家本草，从一些医药名著中摘录有关药物的基本知识和理论，列举了各种疾病的名称和治疗这些疾病的主要药物种类，附有图示三卷共一千一百六十幅。
《本草纲目》的科学成就，主要体现在中医学方面。它建立了本草新体系，内容全面，论述系统，增加了新药，纠正了错误，发展了药性理论；它既论药又论医，是一部医药结合的宝典，创立、发展了新的医学理论与思想，贡献了大量临床医疗经验。《本草纲目》实为历代研究中医学、中药学及中国医学史、药学史的必读书目。
同时，《本草纲目》也是一部古代百科全书。
它运用了通常达变的辩证思维方法，体现了李时珍朴素的唯物主义思想，反映了16世纪中国传统哲学的重要成就。无论研究哲学，还是宗教、民俗，都可从中发现有用的资料。
它记载的十六部六十类中药，包括了无机物、有机物、动物、植物共一千多个品种。李时珍在分析、论述这些药物时，涉及了动植物的生态、生长环境、培植繁育方法和矿物的特性、产地、采制手段等许多科学知识。它对植物学、动物学、矿物学、化学、地质学、物候学及农林牧渔生产技术、冶炼技术具有研究价值。
它对每一种药物的历史渊源、主要产地、发现过程、贸易交流等方面，都作了详细记载，对研究中国传统文化如历史、地理、文字学、训诂学等有着重要的参考作用。
……
难怪《本草纲目》初版时，当时的文坛领袖王世贞即在序言中称赞此书“上自坟典，下及传奇，凡有相关，靡不备采……实性理之精微，格物之通典。”又说打开此书“如入金谷之园，种色夺目；如登龙君之宫，宝藏备悉。”可见此书一出，即光采灼灼，使有识之人、有学之士、方家学者为之倾倒。